Principe de la chromatographie

Le principe repose sur les équilibres de concentration des composés présents entre deux phases non miscibles dont l’une dite stationnaire est emprisonnée dans une colonne, ou fixée sur un support, et l’autre dite mobile qui se déplace au contact de la première.

L’entraînement, à des vitesses différentes, des composés présents par la phase mobile conduit à leur séparation.

A l'instant initial, le mélange à séparer est injecté à l'entrée de la colonne où il se dilue dans la phase mobile qui l'entraîne à travers la colonne.

Si la phase stationnaire a été bien choisie, les constituants du mélange, appelés généralement les solutés, sont inégalement retenus lors de la traversée de la colonne.

De ce phénomène appelé rétention résulte que les constituants du mélange injecté se déplacent tous moins vite que la phase mobile et que leurs vitesses de déplacement sont différentes. Ils sont ainsi élués de la colonne les uns après les autres et donc séparés.

Un détecteur placé à la sortie de la colonne couplé à un intégrateur permet d'obtenir un tracé appelé chromatogramme. Il dirige sur l’intégrateur un signal constant appelé ligne de base en présence du fluide porteur seul ; au passage de chaque soluté séparé il conduit dans le temps à l'enregistrement d'un pic.

Dans des conditions chromatographiques données, le "temps de rétention" (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne et détecté), caractérise qualitativement une substance. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque soluté dans le mélange injecté.

Chromatographie sur couche mince (CCM)

Appelé aussi chromatographie planaire, la CCM repose principalement sur des phénomènes d’adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d’une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d’aluminium.

Après que l’échantillon ait été déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du solvant.

Lorsque les conditions opératoires sont connues, la CCM permet un contrôle aisé et rapide de la pureté d’un composé organique. Si l’analyse, réalisée avec divers solvants et différents adsorbants, révèle la présence d’une seule substance, on peut alors considérer que cet échantillon est probablement pur.

De plus, étant donné que la chromatographie sur couche mince indique le nombre de composants d’un mélange, on peut l’employer pour suivre la progression d’une réaction.

Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

Le principe de la séparation par CPG consiste à partager l'échantillon à analyser entre deux phases. L'une de ces phases est un liquide stationnaire uniformément réparti sous forme d'une pellicule mince sur un solide inerte de grande surface spécifique, tandis que l'autre phase est un gaz mobile qui s'écoule à travers l'ensemble stationnaire.

Un chromatographe est constitué de trois organes essentiels, l'injecteur, le four contenant la colonne, le détecteur.

L’injecteur

Il permet d'introduire un liquide qui doit être vaporisé instantanément avant d'être transféré dans la colonne.

La colonne

Il y a deux types de colonne : remplie et capillaire

• Pour les colonnes remplies, la phase stationnaire est immobilisée par imprégnation ou par réaction chimique avec le support poreux.
• Pour les colonnes capillaires, une faible épaisseur de phase stationnaire est soit déposée soit greffée sur la surface interne de la colonne

La réussite d'une bonne séparation chromatographique dépend dans une large mesure du choix de la phase stationnaire.

En général, les phases polaires (polyéthylène glycols, …) retiennent plus les composés polaires, les colonnes apolaires (polysiloxanes, …) retiennent plus les composés du même nom.

Le détecteur

Il permet de mettre en évidence le passage des différents gaz séparés par la colonne. La détection peut être basée sur des techniques de mesures différentes.

Actuellement deux types de détecteur sont utilisés sur la plateforme de chimie analytique :

• TCD conductibilité thermique appelé catharomètre. Il est basé sur la mesure des variations de conductibilité thermique des mélanges gazeux en fonction de leur composition. Le catharomètre est à réponse universelle, mais relativement peu sensible.
• FID, détecteur à ionisation de flamme. C’est un détecteur beaucoup plus sensible que le catharomètre, mais il ne donne de réponse qu’aux composés organiques. L’échantillon apporté par le gaz vecteur après séparation sur la colonne est brûlé dans une flamme d’hydrogène-air. Cette combustion forme des ions et particules chargées, responsable du passage d’un courant d’ionisation, entre deux électrodes, que l’on amplifie grâce à un électromètre.

Chromatographie liquide haute performance (HPLC)

En HPLC, la phase mobile est un liquide.

Elle sera donc préférée à la CPG dans le cas de composés thermosensibles ou de masse moléculaire très grande et/ou polaire.

De plus, la possibilité d’agir sur la sélectivité entre les composés par le choix de la colonne et de la composition de l’éluant (donc l’interaction soluté/phase mobile/phase stationnaire) rend l’HPLC très utile.

Une chaîne HPLC est composée principalement de :

• Un réservoir de solvant (éluant) qui contient la phase mobile.
• La pompe : elle est munie d'un système de gradient permettant d'effectuer une programmation de la nature du solvant. Elle permet de travailler :
  • en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de l'analyse.
  • en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des constituants du mélange d'éluant.
• Vanne d'injection : c'est un injecteur à boucles d’échantillonnage. Il existe des boucles de différents volumes, nous utilisons généralement au laboratoire une boucle de 20µl. Le choix du volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et de la concentration supposée des produits à analyser. Le système de la boucle d'injection permet d'avoir un volume injecté constant, ce qui est important pour l'analyse quantitative.

La colonne

Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux produits chimiques, souvent en inox ou en verre. Sa section est constante, de diamètre compris entre 4 et 20 mm pour des longueurs généralement de 15 à 30 cm. Au delà, les importantes pertes de charges exigeraient des pressions de liquide beaucoup trop élevées.

Les principales phases stationnaires utilisées sont :

• La phase normale. La phase dite « normale » est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut donc utiliser un éluant peu polaire (apolaire). Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaires qui sortent en tête.
• La phase inverse. La phase inverse est majoritairement composée de silice greffée par des chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est très peu polaire (apolaire) et nécessite donc un éluant polaire. Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier. Contrairement à une phase normale, il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours du temps, et la qualité de la séparation est donc maintenue constante.

Détecteurs

Les principaux détecteurs utilisés sur la plateforme sont les suivants : détecteur UV (classique ou à barrette de diodes) et détecteur électrochimique.

• Détecteur UV-visible (voir spectrométrie UV-visible) : il mesure l'absorption de la lumière par le produit à la sortie de la colonne. On opère à longueur d'onde constante, celle-ci ayant été fixée par l'opérateur. La lampe Deutérium est utilisée pour des longueurs d'onde variant de 190-350 nm. Pour que ce type de détecteur soit utilisable, il faut que :
  • le produit à détecter absorbe la lumière à une longueur d'onde accessible à l'appareil, et que son coefficient d'absorption λ soit suffisamment grand ;
  • la phase mobile n'absorbe pas la lumière à la longueur d'onde choisie par l'opérateur.
• Le détecteur à barrette de diodes permet d’obtenir un domaine de longueurs d’onde simultanément. Il fournit en plus du chromatogramme des renseignements spectraux à fin d’assurer l’identité des composés séparés. Ce détecteur est composé d’une rangée de diodes, chacune indiquant l’absorbance moyenne sur un intervalle très étroit de longueur d’onde. Les données sont collectées par l'intermédiaire soit d'un intégrateur ou d'une station d'acquisition.